免疫組織化學(xué)(Immunocytochemistry, IHC) 是一門利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標記抗體的顯色劑顯色的技術(shù)，能夠?qū)M織細胞內(nèi)的抗原進行定位、定性及相對定量檢測，進而深入探究其功能。
IHC實驗步驟繁瑣，包括切片制作（固定，脫水，透明，包埋，切片，貼片，烤片），脫蠟，水化，阻斷，抗原修復(fù)，封閉，一抗孵育，二抗孵育，顯色，復(fù)染，封片和分析等，每一個細節(jié)都可能影響到最終的染色結(jié)果。無論是從沒做過IHC的實驗小白，還是想要對當(dāng)前方法進行優(yōu)化的大牛，這篇秘籍都能讓您有所收獲。
切片制作
1.染色結(jié)果不理想，細胞核發(fā)灰模糊，對比不鮮明。
解決方法：①半小時內(nèi)完成取材，組織離體后盡快固定；
②固定液選擇視組織而定，有致密外膜用Carnoy液，活檢用Bouin液，固定液體積要超過組織體積5倍以上，量少應(yīng)中途換液1～3次；
③固定時間在4～24 h之間，長時間固定會影響抗原決定簇的暴露，且容易出現(xiàn)自發(fā)熒光及非特異性染色。
2.蠟塊出現(xiàn)組織收縮凹陷，在抗原修復(fù)時脫片。
解決方法：①梯度酒精脫水盡量徹底充分；
②二甲苯脫蠟時間不宜長，1～3 h最佳，脫蠟過度會導(dǎo)致組織發(fā)硬發(fā)脆；
③浸蠟應(yīng)選擇低熔點的石蠟，并充分浸蠟；
④抗原修復(fù)時，高壓時間過長，應(yīng)適當(dāng)縮短時間。
3.切片太厚，脫片，影響染色結(jié)果。
解決方法：①切片厚度視組織而定，如同淋巴結(jié)、腎等組織需要比較?。ú怀^3 um），腦組織需要較厚（尤其是取新鮮標本冰凍制片時），6-8 um最佳，冰凍可切至10 um；其他一般如胃腸道、肝膽等等組織，2-4 um為宜，太厚易導(dǎo)致細胞重疊，影響觀察；
②切片角度和刀片新舊程度對切片效果的影響較大，切片角度視切片機型號而異，新刀片更易切出完好的切片；
③撈片要求一步到位，輕夾輕放，達到無皺折、無氣泡，水溫控制在40℃左右；
④粘片時玻片可用多聚賴氨酸或蛋白甘油處理，或選擇防脫片，以增強粘附性；
⑤烘干溫度為50℃，時間為12～24 h。
4.染色不均勻。
解決方法：①切片厚度不一致，需更換刀片，調(diào)整切片機狀態(tài)；
②試劑配制未混勻，導(dǎo)致局部濃度不一致，應(yīng)將試劑充分混勻后滴加；
③在滴加試劑時讓試劑完全覆蓋組織；
④脫蠟不完全，可更換脫蠟劑或延長脫蠟時間。
5.切片邊緣著色（邊緣效應(yīng)）。
解決方法：①組織邊緣與玻片粘貼不牢，邊緣組織松脫漂浮在液體中，每次清洗不易將組織下面試劑洗盡。玻片清洗干凈后應(yīng)用APES或多聚賴氨酸處理，并確保組織切片盡量薄，盡量避免選用壞死較多的組織；
②切片上滴加的試劑未覆蓋均勻或未覆蓋到全部組織，邊緣的試劑少，容易變干，導(dǎo)致邊緣的試劑濃度比中心區(qū)域的高，而使得染色結(jié)果偏深。滴加試劑時要均勻且充分覆蓋到全部組織，為防止邊緣水分減少，滴加試劑時可以適當(dāng)超出組織邊緣2 mm左右，保證組織部分覆蓋均勻。用組化筆畫圈時，距組織邊緣3-4 mm為宜，避免油劑對實驗結(jié)果的影響。
6.目標蛋白定位異常。
解決方法：①使用新鮮組織切片，
②固定不充分導(dǎo)致組織自溶，損壞，適當(dāng)延長固定時間；
③根據(jù)組織大小，提高固定劑與組織的比例，切取小組織塊，浸泡固定更加充分；
④固定劑使用不當(dāng)，根據(jù)目標蛋白和樣品組織性質(zhì)選擇不同固定劑；
⑤優(yōu)化固定條件，包括濃度、溫度、固定時間等；
⑥抗原擴散，嘗試使用交聯(lián)固定劑而不是有機（醇類）固定劑。
7.染色結(jié)果呈弱陽性。
解決方法：①不當(dāng)?shù)墓潭ǚ绞交蚬潭〞r溫度過高，影響待測抗原的數(shù)量和質(zhì)量，應(yīng)根據(jù)組織選擇更適宜的固定方式及溫度。
8.陽性檢測率及著色強度相對減弱，甚至無染色。
解決方法：①固定液封閉了抗體識別表位，應(yīng)縮短固定時間，增加抗原修復(fù)；
②靶蛋白含量低，建議增加抗體使用量或利用放大步驟來放大信號；
③靶蛋白為膜蛋白而表位可能因為滲透作用被破壞或移除，建議將緩沖液中的滲透試劑減少或移除。
④組織較厚，建議做細胞破膜，以便抗體順利進入胞內(nèi)與相應(yīng)抗原結(jié)合。
抗原修復(fù)
1. 陽性檢測率及著色強度相對減弱，甚至無染色。
解決方法：①抗原修復(fù)緩沖液有多種，常用的有檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0），EDTA緩沖液（pH 8.0-9.0），Tris / Tris-EDTA緩沖液（pH 9.0-10.0），和胰酶（pH 3.5±0.2），修復(fù)液的PH值對染色結(jié)果的影響比較大，具體選擇應(yīng)視情況而定；
②抗原修復(fù)不足，由于固定步驟引起的蛋白交聯(lián)導(dǎo)致抗原仍未被修復(fù)會導(dǎo)致染色減弱，需使用正確的抗原修復(fù)方法，如微波熱修復(fù)及高壓熱修復(fù)等；
③迅速冷卻，加熱結(jié)束后迅速用冷水澆淋使修復(fù)液急速降溫，可能造成抗原暴露不充分，且降溫太快，組織和載玻片的收縮系數(shù)不同易使組織脫片，應(yīng)采用平緩冷卻，即讓修復(fù)液溫度平緩下降的方式。
2.背景染色較深。
解決方法：①固定過度，需摸索修復(fù)條件，改變抗原修復(fù)方法或減小抗原修復(fù)強度；
②抗原修復(fù)過程中，切片干涸。修復(fù)液溢出后未及時補充液體、染色切片太多、動作太慢、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變干的原因。解決的辦法是操作要認真仔細，采用DAKO筆或PAP Pen在組織周圍畫圈，可以有效的避免液體流失，提高操作速度；
③避免切片在緩沖液或修復(fù)液中浸泡時間過長（大于 24 h）。
3.結(jié)果出現(xiàn)弱陽。
解決方法：①不適當(dāng)?shù)目乖迯?fù)方式，導(dǎo)致抗原決定簇暴露不足，需摸索修復(fù)條件，改變抗原修復(fù)方法。
4.目標蛋白定位異常。
解決方法：①抗原修復(fù)過強，導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)被破壞，蛋白轉(zhuǎn)移。應(yīng)優(yōu)化抗原修復(fù)程序或嘗試不同的抗原修復(fù)方法，注意保留組織完整形態(tài)。
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